Termostabilna polimeraza DNA z wirusowego metagenomu jest silnym enzymem RT-PCR

    1. Wirusowe biblioteki metagenomiczne są obiecującym, ale wcześniej niewykorzystanym źródłem nowych enzymów odczynnikowych. Głębokie sekwencjonowanie i funkcjonalne badanie przesiewowe wirusowego metagenomicznego DNA z blisko wrzącej puli termicznej pozwoliło zidentyfikować klony wyrażające aktywność termostabilnej polimerazy DNA (Pol).
    2. Wśród nich 3173 Pol wykazywał zarówno wysoką termostabilność, jak i wrodzoną aktywność odwrotnej transkryptazy (RT). Opisujemy biochemię 3173 Pol i opisujemy jego zastosowanie w jednoenzymowej reakcji PCR z odwrotną transkrypcją (RT-PCR). 3173 Pol typu dzikiego zawiera korektorską domenę 3′-5′ egzonukleazy, która zapewnia wysoką dokładność w reakcji PCR. Łatwiejsza w użyciu pochodna z niedoborem egzonukleazy została włączona do a
    3. PyroScript RT-PCR master  mix i porównanie z jednoenzymowymi (Tth) i dwuenzymatycznymi (MMLV RT/ Taq ) systemami RT-PCR do ilościowego wykrywania docelowych RNA MS2, RNA wirusa grypy A i mRNA. Swoistość i czułość RT-PCR opartej na 3173 Pol były wyższe niż Tth Pol i porównywalne z trzema powszechnymi układami dwuenzymatycznymi. Wydajność i uproszczona konfiguracja czynią ten enzym potencjalną alternatywą dla badań i diagnostyki molekularnej.

    Optymalizacja metody izotermicznej amplifikacji do wykrywania i wizualizacji Mycobacterium tuberculosis do prac terenowych.

    • <AbstractText>Gruźlica jest nadal jedną z najbardziej zaraźliwych chorób na świecie. Kluczowe czynniki kontroli gruźlicy to szybka diagnostyka, skuteczne leczenie i zapobieganie zakażeniom poprzez nadzór i monitorowanie. Jednak hodowla jest złotym standardem w laboratoryjnej diagnostyce gruźlicy; wyniki są do uzyskania za kilka tygodni. Aby nie dopuścić do zakażenia gruźlicą, należy jak najszybciej postawić diagnozę i jak najszybciej rozpocząć leczenie.
    • Celem tego badania jest optymalizacja metody pętli izotermicznej amplifikacji za pośrednictwem pętli (LAMP), która zapewnia znacznie szybszy i czulszy wynik niż metoda PCR oraz umożliwia replikację docelowych sekwencji kwasów nukleinowych w warunkach izotermicznych bez konieczności posiadania infrastruktury laboratoryjnej. </AbstractText><AbstractText>Próbki plwociny homogenizowano 5% roztworem trypsyny w CaCl2 w celu uzyskania DNA. DNA oczyszczono przy użyciu mini zestawu QIAGEN QIAamp DNA.
    • Startery LAMP zaprojektowano przy użyciu programu Primer explorer V5 zgodnie z genem IS6110 Mycobacterium tuberculosis. Do reakcji LAMP użyto zestawu NEB Bst 3.0 do polimerazy DNA. Poza tym, reakcje LAMP porównano z metodą RT-PCR opartą na <em>Taq</em>Man przy użyciu zestawu do polimerazy <em>Taq</em> firmy NEB. Na koniec, do wizualizacji produktów LAMP, prętów pomiarowych z przepływem bocznym wyprodukowanych przez Milenia Biotec, kolorymetrycznych <em>2X</em> LAMP <em>master</em> mix wyprodukowanych przez NEB i metody elektroforezy na żelu agarozowym %2 w/v zostały użyte.</AbstractText>
    • <AbstractText> Stwierdzono, że optymalna temperatura amplifikacji dla LAMP wynosi 71,4 °C. Granica wykrywalności metody wynosiła 102 CFU/ml, a czułość określono jako 100% w porównaniu z pięcioma różnymi gatunkami Mycobacterium.</AbstractText>
    • <AbstractText>Obecne badanie wykazało, że protokół LAMP-LFD i kolorymetryczny LAMP zoptymalizowany z próbkami plwociny może być niezawodny jako szybki, czuły i specyficzny test w diagnostyce gruźlicy w terenie.</AbstractText>

    Wpływ niedopasowania starter-matryca na wykrywanie i oznaczanie ilościowe kwasów nukleinowych przy użyciu testu 5′-nukleazy.

    • Reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (PCR) jest obecnie wybieraną metodą wykrywania i oznaczania ilościowego kwasów nukleinowych, zwłaszcza w diagnostyce molekularnej. Komplementarność starterów i matrycy jest często kluczowa w zastosowaniach PCR, ponieważ niedopasowania mogą poważnie zmniejszyć wydajność starterów.
    • Jednak dostępnych jest niewiele danych ilościowych na temat skutków tych niedopasowań. Zbadaliśmy ilościowo wpływ niedopasowania starter-matryca w regionie startera 3′-końca na PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu testu 5′-nukleazy. Nasze wyniki pokazują, że pojedyncze niezgodności wywołują szeroką gamę efektów, od niewielkich (próg <1,5 cyklu, np. AC, CA, TG, GT) do poważnych (próg >7,0 cyklu, np. AA, GA, AG, CC). ) o amplifikacji PCR.
    • Stwierdzono wyraźną zależność między konkretnymi typami niezgodności, pozycją i wpływem, która pozostała spójna dla amplifikacji DNA w porównaniu z RNA i  wirusa białaczki mysiej Taq /Moloneya w porównaniu z amplifikacjami opartymi na rTth.
    • Całkowity rozmiar oddziaływania pomiędzy różnymi   zastosowanymi mieszankami podstawowymi różnił się znacznie (nawet siedmiokrotnie), a dla niektórych  mieszanek głównych  zaobserwowano specyficzne dla startera oddziaływanie wsteczne lub lewe, co podkreśla znaczenie zastosowanych warunków doświadczalnych .
    • Zebrane razem dane te sugerują, że wpływ niedopasowania przebiega zgodnie ze spójnym wzorcem i umożliwiło nam sformułowanie kilku wytycznych dotyczących przewidywania zachowania niezgodności starter-matryca przy użyciu specyficznych mieszanek głównych testów 5-  nukleazowych  .
    • Nasze badanie zapewnia nowy wgląd w zachowanie niezgodności i powinno pozwolić na bardziej zoptymalizowany rozwój testów PCR w czasie rzeczywistym obejmujących niedopasowania starterów i szablonów.

    Porównanie wieloplatformowe dziesięciu komercyjnych  mieszanek wzorcowych  do wykrywania w czasie rzeczywistym reakcji łańcuchowej polimerazy opartej na próbnikach czynników zagrażających bioterroryzmowi w celu zapewnienia gotowości na przepięcia.

    • Centra Kontroli i Prewencji Chorób oraz Instytut Badawczy Chorób Zakaźnych Armii Stanów Zjednoczonych opracował testy PCR w czasie rzeczywistym do wykrywania czynników zagrażających bioterroryzmowi. Wszystkie te testy opierają się na ograniczonej liczbie zatwierdzonych mastermiksów PCR w czasie rzeczywistym   .
    • Ponieważ dostępność tych odczynników jest krytycznym elementem gotowości do bioterroryzmu, podjęliśmy wspólne ogólnokrajowe ćwiczenie w zakresie gotowości w celu zaspokojenia potencjalnego wzrostu potrzeb wynikających z zagrożenia biologicznego na dużą skalę.
    • Zidentyfikowaliśmy 9 dostępnych na rynku potencjalnych alternatyw dla istniejącej zatwierdzonej  mieszanki głównej  (LightCycler FastStart DNA  Master  HybProbes):  mieszanka główna Taq Man Fast Universal PCR  , OmniMix  HS, mieszanka główna FAST qPCR  ,  zestaw EXPRESS qPCR SuperMix, zestaw QuantiFast Probe PCR, LightCycler FastStart DNA  Master (PLUS) HybProbe, Brilliant II FAST miks qPCR  , ABSolute  Fast QPCR Mix i
    •  Mieszanka główna HotStart IT  Taq .  Wydajność tych zestawów oceniono za pomocą testów PCR w czasie rzeczywistym dla czterech czynników zagrażających bioterroryzmowi: Bacillus anthracis, Brucella melitensis, Burkholderia mallei i Francisella tularensis.
    • Mieszanki  główne  porównano pod kątem poziomów wykrywania specyficznych dla celu, a także spójności wyników między trzema różnymi platformami PCR w czasie rzeczywistym (LightCycler, SmartCycler i 7500 Fast Dx).
    • Analiza PCR w czasie rzeczywistym wykazała, że ​​wszystkie dziesięć zestawów spisało się dobrze w wykrywaniu czynnika w aparacie 7500 Fast Dx; jednak zestaw QuantiFast Probe PCR dał najbardziej konsekwentnie pozytywne wyniki na wielu platformach PCR w czasie rzeczywistym.
    • Zgłaszamy, że niektóre kombinacje powszechnie stosowanych  mastermiksów  i instrumentów nie są tak niezawodne jak inne w wykrywaniu niskich stężeń docelowego DNA. Ponadto nasze badanie zapewnia laboratoriom możliwość wyboru spośród ocenianych przez nas komercyjnych zestawów, aby odpowiadały ich potrzebom w zakresie przygotowania.

    Opracowanie wewnętrznie kontrolowanego uniwersalnego testu reakcji łańcuchowej polimerazy 16S rDNA w czasie rzeczywistym ze wzmocnieniem monoazydku etydyny do wykrywania zanieczyszczenia bakteryjnego w koncentratach płytek krwi.

    1. Skażenie bakteryjne koncentratów płytek krwi (PLT) pozostaje problemem dla usług transfuzji krwi. Dostępne są oparte na kulturach techniki przesiewowego badania bakterii, ale oferują one niewystarczającą szybkość i czułość. Opisano alternatywne techniki oparte na amplifikacji reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR), ale ich działanie jest często zagrożone przez ślady bakteryjnego DNA w odczynnikach.
    2. Zastosowano uniwersalne startery 16S rDNA do opracowania testu PCR w czasie rzeczywistym ( Taq Man, Applied Biosystems) i zbadano różne strategie odkażania odczynników. Czułość wykrywania oceniano przez dodanie koncentratów PLT o znanych stężeniach 13 różnych organizmów.
    3. Trawienie enzymami restrykcyjnymi,  ultrafiltracja  mastermixu i zastosowanie alternatywnych  polimeraz Taq  w pewnym stopniu zmniejszyły poziom zanieczyszczenia DNA odczynnika, ale wszystkie okazały się zawodne. W przeciwieństwie do tego, traktowanie mastermixu PCR monoazydkiem etydyny (EMA),  a  następnie fotoaktywacja było niezawodne i skuteczne, pozwalając na pełne 40 cykli amplifikacji i całkowicie eliminując zanieczyszczenie bez pogorszenia czułości testu. Wszystkie 13 organizmów zostało skutecznie wykrytych, a granica wykrywalności PLT wzbogaconych Escherichia coli wynosiła około 1 jednostka tworząca kolonie/ml.
    4. Koamplifikacja ludzkiego mitochondrialnego DNA posłużyła do potwierdzenia skutecznej ekstrakcji kwasów nukleinowych i braku inhibicji PCR w każdej próbce. Stwierdzono, że jedna z pięciu ocenianych zautomatyzowanych platform ekstrakcyjnych jest wolna od zanieczyszczeń i zdolna do wysokowydajnego przetwarzania.

    Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)

    BS9295 Bio Basic 1ml 84.8 EUR

    Taq PCR Master Mix (2X, Blue Dye)

    BS9296 Bio Basic 5ml 189.2 EUR

    Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)

    BS9297 Bio Basic 1ml 84.8 EUR

    Taq PCR Master Mix (2X, Red Dye)

    BS9298 Bio Basic 5ml 189.2 EUR

    Hot Start Taq 2x Master Mix - 500 Reactions

    3296 Intact Genomics 1/EA 268 EUR

    2 × Taq Master Mix

    P111-01 Vazyme 5 ml 117 EUR

    2 × Taq Master Mix

    P111-02 Vazyme 15 ml 146 EUR

    2 × Taq Master Mix

    P111-03 Vazyme 50 ml 236 EUR

    Accuris Taq Master Mix

    PR1001-1000 Benchmark Scientific 1 PC 300.26 EUR

    Accuris Taq Master Mix

    PR1001-200 Benchmark Scientific 1 PC 121.62 EUR

    Accuris Taq Master Mix

    PR1001-S Benchmark Scientific 1 PC 69.79 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix

    P211-01 Vazyme 5 ml 134 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix

    P211-02 Vazyme 15 ml 193 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix

    P211-03 Vazyme 50 ml 389 EUR

    2 × Rapid Taq Master Mix

    P222-01 Vazyme 5 ml (5×1ml) 120 EUR

    2 × Rapid Taq Master Mix

    P222-02 Vazyme 15 ml (15×1ml) 153 EUR

    2 × Rapid Taq Master Mix

    P222-03 Vazyme 50 ml (50 x 1 ml) 257 EUR

    2 × Rapid Taq Master Mix

    P222-04 Vazyme 50 ml (10×5ml) 257 EUR

    Accuris Taq Plus Master Mix

    PR1001-TP-1000 Benchmark Scientific 1 PC 827.41 EUR

    Accuris Taq Plus Master Mix

    PR1001-TP-200 Benchmark Scientific 1 PC 242.84 EUR

    Accuris Taq Plus Master Mix

    PR1001-TP-S Benchmark Scientific 1 PC 69.79 EUR

    Taq 2x PCR Mix 100 rxn

    BA01501 Bioatlas 100rxn 94 EUR

    2xEs Taq Master Mix (with Dyes)

    W0690-1 101Bio - Ask for price

    2xEs Taq Master Mix (with Dyes)

    W0690-5 101Bio - Ask for price

    2× EpiArt HS Taq Master Mix

    EM201-01 Vazyme 1ml 145 EUR

    2× EpiArt HS Taq Master Mix

    EM201-02 Vazyme 5 ml (5×1ml) 303 EUR

    2× EpiArt HS Taq Master Mix

    EM201-03 Vazyme 15 ml (15×1ml) 642 EUR

    2 × Taq Master Mix (Dye Plus)

    P112-01 Vazyme 5 ml 117 EUR

    2 × Taq Master Mix (Dye Plus)

    P112-02 Vazyme 15 ml 146 EUR

    2 × Taq Master Mix (Dye Plus)

    P112-03 Vazyme 50 ml 236 EUR

    Accuris Hot Start Taq Master Mix

    PR1001-HS-1000 Benchmark Scientific 1 PC 490.87 EUR

    Accuris Hot Start Taq Master Mix

    PR1001-HS-200 Benchmark Scientific 1 PC 169.47 EUR

    Accuris Taq Master Mix Red Dye

    PR1001-R-1000 Benchmark Scientific 1 PC 300.26 EUR

    Accuris Taq Master Mix Red Dye

    PR1001-R-200 Benchmark Scientific 1 PC 121.62 EUR

    Accuris Taq Master Mix Red Dye

    PR1001-R-S Benchmark Scientific 1 PC 69.79 EUR

    Pfu 2x Master Mix - 200 Reactions

    3326 Intact Genomics 1/EA 300 EUR

    amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

    P7000-005 GenDepot 5x1 ml 219 EUR

    amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

    P7000-010 GenDepot 10x1 ml 317 EUR

    amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

    P7000-050 GenDepot 50x1 ml 1211 EUR

    amfiSure ONE PCR Master Mix(2X)

    P7000-100 GenDepot 100x1 ml 2102 EUR

    Gloria Nova HS 2x Master Mix

    RK20717 Abclonal 1mL Ask for price

    Entrans 2X qPCR Probe Master Mix

    RK21208 Abclonal 40 RXN Ask for price

    2x SYBR Green qPCR Master Mix

    B21202 Bimake 5 mL 224 EUR

    2x SYBR Green qPCR Master Mix

    B21203 Bimake 25 mL 856 EUR

    2×Taq PCR Master Mix(with dye)

    K1034-1 ApexBio 1 ml 73 EUR

    2×Taq PCR Master Mix(with dye)

    K1034-100 ApexBio 100×1 ml 792 EUR

    2×Taq PCR Master Mix(with dye)

    K1034-20 ApexBio 20×1 ml 282 EUR

    2×Taq PCR Master Mix(with dye)

    K1034-5 ApexBio 5×1 ml 119 EUR

    2×Taq PCR Master Mix(with dye)

    K1034-50 ApexBio 50×1 ml 514 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix (Dye Plus)

    P212-01 Vazyme 5 ml 133 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix (Dye Plus)

    P212-02 Vazyme 15 ml 193 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix (Dye Plus)

    P212-03 Vazyme 50 ml 389 EUR

    HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)

    BS9291 Bio Basic 5X1mL, 5ml 209.5 EUR

    HotStart PCR Master mix (2X, Green Dye)

    BS9292 Bio Basic 1ml 96.4 EUR

    amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0342-010 GenDepot 2x50 rxns 253 EUR

    amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0342-025 GenDepot 5X50 rxns 455 EUR

    amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0342-050 GenDepot 10X50 rxns 779 EUR

    amfiFusion High Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0342-100 GenDepot 20x50 rxns 1333 EUR

    amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0346-001 GenDepot 1ml 280 EUR

    amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0346-002 GenDepot 2x1ml 482 EUR

    amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0346-005 GenDepot 5x1ml 828 EUR

    amfiSure Ultra Fidelity PCR Master Mix(2X)

    P0346-010 GenDepot 10x1ml 1360 EUR

    2× EpiArt HS Taq Master Mix (Dye Plus)

    EM202-01 Vazyme 1ml 145 EUR

    2× EpiArt HS Taq Master Mix (Dye Plus)

    EM202-02 Vazyme 5 ml (5×1ml) 303 EUR

    2× EpiArt HS Taq Master Mix (Dye Plus)

    EM202-03 Vazyme 15 ml (15×1ml) 642 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)

    P213-01 Vazyme 5 ml 134 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)

    P213-02 Vazyme 15 ml 193 EUR

    2 × Taq Plus Master Mix II (Dye Plus)

    P213-03 Vazyme 50 ml 389 EUR

    Accuris Hot Start Taq Master Mix Red Dye

    PR1001-HSR-1000 Benchmark Scientific 1 PC 490.87 EUR

    Accuris Hot Start Taq Master Mix Red Dye

    PR1001-HSR-200 Benchmark Scientific 1 PC 169.47 EUR

    Accuris Hot Start Taq Master Mix Red Dye

    PR1001-HSR-S Benchmark Scientific 1 PC 69.79 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5601-001 GenDepot 1ml 146 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5601-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5601-005 GenDepot 5x1ml 266 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5601-010 GenDepot 10x1ml 442 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5601-050 GenDepot 50x1ml 1670 EUR

    amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5701-001 GenDepot 1ml 174 EUR

    amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5701-002 GenDepot 2x1ml 266 EUR

    amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5701-005 GenDepot 5x1ml 469 EUR

    amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5701-010 GenDepot 10x1ml 739 EUR

    amfiSure qProbe Q-PCR Master Mix(2X), Fluorescein

    Q5701-050 GenDepot 50x1ml 2885 EUR

    2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)

    B21402 Bimake 5 ml 224 EUR

    2x SYBR Green qPCR Master Mix (High ROX)

    B21403 Bimake 25 ml 856 EUR

    2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)

    B21702 Bimake 5 ml 224 EUR

    2x SYBR Green qPCR Master Mix (Low ROX)

    B21703 Bimake 25 ml 856 EUR

    ig SYBR Green qPCR 2X Master Mix - 500 Reactions

    3356 Intact Genomics 1/EA 288 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

    Q5600-001 GenDepot 1ml 146 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

    Q5600-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

    Q5600-005 GenDepot 5x1ml 269 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

    Q5600-010 GenDepot 10x1ml 448 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), No Rox

    Q5600-050 GenDepot 50x1ml 1738 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

    Q5602-001 GenDepot 1ml 146 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

    Q5602-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

    Q5602-005 GenDepot 5x1ml 266 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

    Q5602-010 GenDepot 10x1ml 442 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), High Rox

    Q5602-050 GenDepot 50x1ml 1670 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

    Q5603-001 GenDepot 1ml 146 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

    Q5603-002 GenDepot 2x1ml 207 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

    Q5603-005 GenDepot 5x1ml 266 EUR

    amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(2X), Low Rox

    Q5603-010 GenDepot 10x1ml 442 EUR
    Sieciowanie EMA do DNA poprzez fotoaktywację rozwiązało wcześniej nierozwiązywalny problem zanieczyszczenia odczynników i umożliwiło opracowanie uniwersalnego systemu wykrywania bakterii o wysokiej czułości. Trwają próby mające na celu ocenę przydatności systemu do wysokoprzepustowego badania przesiewowego koncentratów PLT.

Leave a Reply

Your email address will not be published.